CellCounting Kit-8(CCK-8)相比以前的方法为细胞数测定和细胞增殖/毒性检测提供了更方便和灵敏的方法。试剂盒使用了一种高水溶性的四唑盐，WST-8，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性formazan 形式的染料。由脱氢酶产生的 formazan 的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。CCK-8的检测灵敏度高于其他方法，如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1 等。

细胞增殖/毒性检测

1. 在96 孔板中每孔接种100μl 细胞悬液（约5000个细胞/孔）。将板在潮湿的培养箱中预培养24小时（例如
在37℃,5％CO2 下）。 

2. 向孔中加入10 μl 不同浓度的待测物质。 

3. 将培养板在培养箱中孵育适当的时间长度（例如 6, 12, 24 或48 小时）。 

4. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰 OD 值检测。 

5. 将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。 

6. 在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量450 nm 处的吸光度。

相关问答：

1）Q：每个孔需要接种的细胞数量是多少？

A：对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μL培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μL培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10%。

2）Q：CCK-8对细胞的毒性大小如何？

A：CCK-8的毒性非常低，在CCK-8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐把CCK-8测定过的细胞用于其它实验。）

3）Q：怎么设置空白对照？

A：在不含有细胞的培养基中加入CCK-8，酶标仪检测450 nm的吸光度；若做药物刺激实验，可在不含细胞、含药物的培养基中加入CCK-8。酶标仪检测450 nm的吸光度作为空白对照。

4）Q：CCK-8能否用于细胞染色？

A：CCK-8不能用于细胞染色，CCK-8检测原理是高水溶性的四唑盐WST-8在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性formazan形式的染料，WST-8及formazan是高度水溶性的，不会进入细胞内对细胞进行染色。

5）Q：没有450 nm的滤光片，能否使用其他滤光片？

A：如果您没有450 nm滤光片。您也可以使用吸光度在430 nm和490 nm之间的滤光片, 450 nm滤光片具有最佳灵敏度。

6）Q：哪些物质会干扰CCK-8的测定？

A：WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan，如果使用还原剂（例如一些抗氧化剂）会增加OD值；若存在氧化性物质则会抑制CCK-8测定反应，减小OD值；此外，培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

7）Q：在做药物刺激实验时，药物对测定是否有影响？

A：如果药物有还原性，则会与CCK-8发生反应，影响吸光度；药物中金属离子的存在可能会影响CCK-8的灵敏度。终浓度为1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5% 、15% 、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM 的话，将会100%抑制。

8）Q：如果吸光度值太低，可以采取什么办法？

A：适当增加细胞数量或延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。

9）Q：如果吸光度值太高，可以采取什么办法？

A：适当减少细胞数量（建议正式实验前优化细胞数量与荧光值之间的关系）或缩短加入CCK-8溶液后的孵育时间。

保存方法

CCK-8在0-5°C下，避光保存，储存时间超过一年。如需更长时间储存，请将其储存在-20°C。反复冻融会导致背景增加，干扰您的检测。如果频繁使用，请将试剂盒存放在0-5°C。