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SDScript All-in-One Easy RT SuperMix with dsDNase为全新一代逆转录试剂盒。本产品在一管内融合了基 因组去除与RNA逆转录所需组分,只需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应。产品采用新一代逆转 录酶、dsDNase,配合优化的缓冲液,可快速的完成基因组去除和逆转录反应。
合成的第一链cDNA可 广泛用于文库构建、第二链合成、杂交、PCR扩增、兼容染料法和探针法qPCR等。
优势:
1.一管式逆转录试剂,操作极简便,仅需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应。
2.适用性好:cDNA既可以做模板用于长片段PCR,又可以进行qPCR。
2.高热稳定性,反应温度42-55℃,有助于RNA二级结构打开。
3.逆转录能力强、cDNA合成得率高,片段更长,合成片段≤15 kb。
4.无RNase H活性,避免第一链cDNA合成过程中DNA/RNA杂交体中模板RNA被降解,从而保证第一链cDNA合成量和长度。
5.去除基因组DNA,保证定量结果更加准确 。
第一链cDNA合成
1. 在RNase-free离心管中配制如下混合液 ,轻轻混匀并瞬离以下成分:
组分 | 体积 |
10pg-5μg Total RNA or 10pg-500ng mRNA# | As Required |
DEPC-treated Water | Up to 16 μl |
5×All-in-One Easy RT SuperMix* | 4 μl |
Total Volume | 20 μl |
# 为保证逆转录成功 ,推荐使用1μg高质量RNA模板。
*5×All-in-One Easy RT SuperMix于-20℃保存时 ,有时会形成沉淀 ,可在室温短时间放置后 ,涡旋混匀即可完全溶解。确保试剂混合均匀后再使用 。
2. 按照下表所示进行逆转录反应:
温度 | 时间 | 备注 |
25℃ | 10 min | 引物与RNA模板配对及去除基因组DNA |
55℃ | 15 min | 逆转录反应及dsDNase快速灭活 |
85℃ | 5 min | 逆转录酶完全灭活 |
3. 产物可立即用于PCR或qPCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-70℃保存 ,cDNA应避免反复冻融。推荐产物cDNA用无菌去离子水稀释5~10倍后使用。