EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit确保高灵敏度的可靠定量检测，使用TaqMan探针或双标探针以区分甲基化位点。该试剂盒为即用型试剂盒，无需进一步优化。该试剂盒与各种定量PCR仪兼容，EpiTect MethyLight PCR Kit适用于除Applied Biosystems 7500以外的所有Applied Biosystems的PCR仪。EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit适用于所有其他的PCR仪，包括Applied Biosystems 7500和Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Roche和Stratagene的仪器。

EpiTect MethyLight PCR Kits与EpiTect MethyLight Assays或其他双标探针-引物配合使用，可灵敏定量亚硫酸氢盐转化后DNA中的甲基化DNA。根据对于序列甲基化状态区分程度的要求，MethyLight可用于定量和半定量分析。

双标记探针，包括TaqMan探针，是序列特异性的寡聚核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团。荧光基团在探针的5'末端，而淬灭基团通常在3'末端或中间。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性水解探针，将荧光基团和淬灭基团分离。可检测的荧光量与扩增的PCR产物成正比。

特异性甲基化探针定量MethyLight real-time PCR产物

使用MethyLight PCR进行定量甲基化分析，含有不同荧光标签的两个双标探针与一组PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针，以区分甲基化和非甲基化CpG位点。这些引物特异性针对非甲基化位点。一个探针在某一位点与甲基化DNA特异性结合，而其他探针特异性结合同一位点的非甲基化DNA。不同的探针包含不同的荧光基团，由此定量甲基化和非甲基化序列。

特异性甲基化探针半定量MethyLight real-time PCR产物

对于半定量MethyLight分析，一个双标探针与一组特异性结合某些甲基化位点的PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针，以区分甲基化和非甲基化CpG位点，这些引物要特异性结合甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA。如果甲基化特异性引物结合到DNA上，它会在延伸阶段加长，并且Taq DNA Ploymerase的5'→3'外切酶活性会引起引物降解，释放荧光基团。由于荧光基团与淬灭基团已经隔离，可检测到荧光。

提高特异性

EpiTect MethyLight Master Mix专用于序列特异性探针法高灵敏地检测甲基化和非甲基化DNA。除各种盐类和添加剂，缓冲液含有经优化的KCl和(NH4)₂SO₄组合，提高每个PCR扩增退火过程特异性引物与探针结合的比例。可确保区别探针杂交和检测非甲基化和/或甲基化靶序列。严谨的引物退火条件可在亚硫酸氢盐转化后DNA扩增过程中提高PCR特异性，能够可靠的进行基于探针的甲基化状态检测。

MethyLight PCR的对照反应

为确保用于检测甲基化或非甲基化DNA的MethyLight PCR探针和引物具有特异性，需要进行对照反应。应用不同浓度的亚硫酸氢盐转化后对照DNA（完全甲基化和完全非甲基化）。此外，确定甲基化程度过程中可将这些对照DNA混合物作为定量分析标准。配合EpiTect Control DNA Set（cat:59695），QIAGEN以即用型试剂盒的形式提供所有的对照DNA，包括：甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA、非甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA和人类基因组DNA，用于可靠的、标准化的甲基化特异性对照反应。